Fiabilidade dos resultados do teste de ADN na gravidez

O teste de ADN na gravidez, pode ser realizado de forma invasiva ou não invasiva.

Neste artigo, não iremos analisar os exames invasivos para saber mais sobre o assunto leia o artigo Exame de DNA na Gestação: Invasivo ou Não invasivo?

Até há pouco tempo, o teste de ADN na gravidez necessitava de uma amostra direta de vilosidades coriônicas ou líquido amniótico, através de um procedimento invasivo, procedimento que acarreta risco para a mãe e para o bebé.

Embora os Obstetras e Ginecologistas recomendem que estes procedimentos sejam disponibilizados a todas as mulheres grávidas, normalmente, só são usados quando existe a suspeita de defeitos genéticos na criança.

A descoberta do segundo ADN na corrente sanguínea da mãe

A descoberta do ADN fetal em livre circulação no sangue materno sugere à época que um teste de ADN na gravidez não invasivo pudesse ser desenvolvido.

Isto foi muito importante porque evita os riscos associados a procedimentos invasivos.

Embora o ADN fetal na circulação materna já fosse do conhecimento dos cientistas o desenvolvimento de um teste confiável não invasivo de paternidade ainda era um desafio.

Desde logo, porque o ADN fetal é achado em quantidade muito pequenas, cerca de 20% do total do plasma materno e é altamente fragmentado.

A quantidade limitada de ADN fetal e a sua diluição pelo sangue materno apresenta desafios técnicos significativos.

Então para que este exame pudesse ser desenvolvido foi usada uma tencologia de alto rendimento. NGS –  SNP’s.

O que é um SNP e como se aplica ao teste de ADN na gravidez

Polimorfismos de nucleotídeo único, (fonte) frequentemente chamados SNPs (pronuncia-se “snips”), são o tipo mais comum de variação genética entre as pessoas.

Cada SNP representa uma diferença em um único bloco de construção de DNA, chamado nucleotídeo. Por exemplo, um SNP pode substituir o nucleotídeo citosina (C) pelo nucleotídeo timina (T) numa pequena sequência de DNA.

Um exemplo de um SNP é a substituição de um C por um G na sequência nucleotídica AACCAT, produzindo assim a sequência AACGAT.

Por exemplo, existe uma sequência que é comum a todos os seres humanos. Utilizaremos a sequência AAC (SNP) AT.

Ou seja, onde está escrito SNP é onde existe a variação de pessoa para pessoa, o resto da sequência é igual.

A sequência acima poderá ser AACCAT ou AACGAT ou AACTAT, existe a variação de uma única letra na sequência de base.

O SNP só pode tomar a forma de quatro letras (A, C, G ou T).

Na imagem acima podemos verificar que a sequência é toda igual com exceção das letras CG imagem 1 que se alteraram para TA.

Numa hélix de DNA existem dois alelos um herdado da mãe outro herdado do pai.

No exame de ADN na gravidez a correspondência dos SNP’s é realizada da seguinte forma

Herança genética dos SNP’S

Como pode verificar acima, numa dada sequência genética o alegado pai tem a sequência AT, AT, CG, SNP(CG), TA, AT etc…

A Mãe na mesma posição tem também a mesma sequência AT, AT, CG, SNP(TA), TA, AT etc…

Então a criança na mesma posição, terá a mesma sequência, mas com uma herança maternal e uma herança paternal, vejamos:

AT, AT, CG, SNP(TG), TA, AT etc….

Como referido anteriormente, a criança tem a herança genética dos seus pais biológicos, neste caso herdou o T da Mãe e o G do suposto pai.

Claro que, com a análise de apenas uma região, nada é possível concluir quanto à paternidade.

Mas quando se junta cerca de 2030 regiões para análise, aí, é possível chegar a um nível de precisão muito grande.

Este método em questão é conhecido como parental support, é uma tecnologia que está patenteada e apenas o nosso laboratório parceiro utiliza, por isso, é possível conhecer o método utilizado para chegar ao resultado, mas não as regiões específicas (SNP’s) do ADN analisado.

A fiabilidade dos resultados do teste de paternidade na gravidez

É comum aos laboratórios fazerem testes cegos com participantes para verificar a acuidade dos resultados obtidos.

Neste caso, citámos o estudo da US National Library of Medicine and National Institutes of Health.

As premissas para as «provas cegas» foram:

• A mãe estar grávida há mais de 6 semanas;
• Não estarem grávidas de gémeos;

Foram testadas 21 mulheres e 21 supostos pais.

Veja abaixo os resultados de um teste cego que foi realizado antes do exame de ADN na gravidez ser disponibilizado ao público, este teste cego data de 2011.

É possível retirar algumas conclusões interessantes pela observação dos dados acima.

A primeira conclusão é que a quantidade de ADN fetal encontrado é extremamente baixa, por vezes quase aleatória, existem mães no segundo trimestre que têm menos ADN fetal que mães no primeiro trimestre.

Observe-se caso 4, com 9 semanas tem uma percentagem de ADN fetal de 8.9% (muito mais que suficiente para a conclusão do exame).

Comparando com o caso 20, já no segundo trimestre de gravidez, após a amplificação apenas é encontrado 3,7% de ADN fetal em livre circulação.

Em termos teóricos sabemos que quantas mais semanas de gravidez maior ADN fetal presente na corrente sanguínea.

Por um lado, também vale realçar que, em 21 casos apenas no caso 3 se obteve apenas 0,6% do ADN fetal, pelo que não foi possível obter um número mínimo de SNP para um resultado conclusivo.

Por fim, salientar que nestes 21 casos, 20 dos 21 resultados deram positivos, o pai foi incluído como pai biológico. Em apenas, um, o exame foi inconclusivo.

Após o nascimento da criança, realizaram-se teste de paternidade pós-natais e houve uma confrontação dos resultados.

Como é possível verificar, o acerto do teste de paternidade na gravidez é de 100%, desde que seja possível obter o ADN fetal da corrente sanguínea da mãe.

Considere o exemplo abaixo, em que analisamos uma inlcusão e uma exclusão de paternidade. (representação gráfica)

• (a) inclusão de paternidade e
• (b) exclusão de paternidade.

A legenda do gráfico: a cinza a distribuição estatística do teste, a verde a região que indica inclusão de paternidade, a bege a região que indica exclusão de paternidade e a região que indica paternidade inconclusiva a cor preta.

Esta é a representação gráfica que os analistas têm acesso aquando a execução do exame, após analisados cerca dos 2030 SNP em teste.

Quanto mais afastado é o ponto azul da área preta (exame de ADN inconclusivo), mais fortes são os resultados.

A conclusão do estudo científico.

Foram sujeitos a teste vinte e uma amostras de sangue materno com paternidade desconhecida relatados na tabela acima.

Uma das amostras não pôde ser avaliada devido à baixa fração ADN fetal no plasma materno.

Para cada uma das 20 amostras restantes com ADN fetal suficiente, foram realizados 1.821 testes de paternidade independentes, usando o pai confirmado e um conjunto aleatório de 1.820 indivíduos do sexo masculino não relacionados, para um total de 36.420 testes de paternidade realizados.

Regressando à questão da fiabilidade do exame, o estudo,  confirma a paternidade em 100% (20/20) dos casos.

O teste identificou com precisão a paternidade, logo após, a sexta semana de gravidez mesmo com uma fração baixa de ADN fetal.

É importante realçar que 99,95% (36.382 / 36.400) dos testes excluíram corretamente a paternidade usando o algoritmo patenteado.

Apenas 18 (0,05%) foram considerados indeterminados. Nenhuma das amostras deu um resultado de paternidade incorreto.

Limitações científicas para os resultados do teste e paternidade na gravidez

É importante observar que, se a dúvida é entre dois homens da mesma família (dois irmãos, ou um sobrinho e um tio), ou seja, uma relação biológica direta os resultados podem gerar uma falsa inclusão de paternidade.

Os resultados mostram que, um avô ou tio paterno da criança,  retorna resultados por vezes positivos, embora menores estatisticamente do que o resultado do Pai biológico. Contudo ainda assim, pode gerar ainda um falso positivo.

Por esse motivo, quanto tal acontece (a dúvida é entre duas pessoas da mesma família), deve ser colhida amostra nos dois alegados pais em dúvida, para garantir a identificação da paternidade correta.

Vale a pena realçar que, este teste teve confirmações de paternidade já a partir da 6 semana de gravidez, com uma fração de ADN fetal de apenas 2,3%, sugerindo que o teste de paternidade pode ser realizado muito cedo na gravidez, quando a presença de ADN fetal ainda é muito baixa.

Isto é importante quando, está em causa a interrupção voluntária da gravidez. Veja quais os motivos de o considerar em, o teste de paternidade pré-natal a partir da 8 semana de gestação.

Em resumo, este é um teste de paternidade na gravidez altamente preciso.

Como são apresentados os resultados do teste de paternidade na gravidez atualmente?

Os relatórios dos resultados do teste de paternidade durante a gravidez já tiveram algumas alterações ao longo dos anos.

Ao contrário dos  testes pós-natais, no documento dos resultados do pré-natal os SNP’s não são mostrados.

Desde logo, porque o algoritmo bioinformático é proprietário e patentiado, logo, não é possível ter acesso aos dados genéticos.

Entre o ano de 2015 e 2017 era mostrado um exemplo como o da figura abaixo, mas devido a criar imensa confusão ao recetor do resultado, neste momento nenhum SNP é mostrado.

Na realidade eram mostrados as cinco primeiras linhas das 2030 linhas em teste.

Contudo, iremos recorrer-nos destas tabelas, para poder mostrar como os resultados são analisados em termos de genes e herança biológica.

Como já referido anteriormente, os SNP’s só podem ter assumir quatro letras (A, C, G, e T);

para a exclusão da paternidade: (seria possível visualizar, algo como a tabela abaixo)

ao reparar na tabela acima, pode constatar que, o pai não passa os genes para o filho, o que deveria acontecer se fosse de facto o pai biológico.

para a inclusão da paternidade:

já na inclusão, e representado pela cor vermelha é possível verificar a herança do gene do pai e da mãe aos longo dos SNP’s testados.

…como ler os dados genéticos acima?

Resumidamente, a mãe e o pai passam 50% do seu ADN para o filho(a), logo, cada pai tem que passar um gene para o filho.

Contudo, a combinação de genes do filho(a) é totalmente aleatória e pode tomar qualquer forma, atente no exemplo abaixo.

Neste exemplo a mãe tem o gene AT e o pai o gene CA, contudo o filho irá herdar apenas e unicamente uma letra de cada pai.

São inumeras as combinações, como pode verificar por gene, o filho pode ter até 7 combinações diferentes.

O Laboratório analisa todas estas combinações antes de emitir o resultado.

Regressando ao ponto anterior, os resultados dos testes de ADN na gravidez, são emitidos com a probabilidade de paternidade em percentual e a explicação da tecnologia usada em teste.

• SUPERIOR A 99.9% para resultados de inclusão (positivos);
• 0% parra resultados de exclusão (negativos).

Nenhuma referência aos SNP é realizada no novo formato de emissão.